高活性可溶重组人内皮抑素注射剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种利用大肠杆菌表达系统生产的高活性可溶重组人内皮抑素注射剂的制备方法。其主要特征是，通过50至500立升发酵罐发酵表达，改进大肠杆菌包涵体二次提取工艺技术，使包涵体蛋白复性后纯度达82％以上，并且在小于0.01mol/L的尿素中保持高度的可溶性，再将该内皮抑素包涵体进行复性、超滤浓缩，并用阴离子交换树脂和阳离子交换树脂进行分离纯化，从而获得纯度为96％以上的重组人内皮抑素蛋白。本发明每立升发酵物能够得到40－50mg纯品，年制备量达到数千克以上；体内外活性测定表明，应用本发明技术方案制得的高活性可溶重组人内皮抑素产品，在治疗依赖血管生成疾病的抗血管生成方面具有很好的疗效。

主权项

1.高活性可溶重组人内皮抑素注射剂的制备方法，以表达人皮抑素基因的重组大肠杆菌菌体为原料，经过提取、复性和纯化的工业化处理过程获得重组人内皮抑素蛋白，进而配制成重组人内皮抑素注射剂，其特征在于：所述工业化处理过程具体包含以下两个步骤——(1)从菌体中提取纯度大于82％的包涵体蛋白：首先将包涵体用洗涤液A及异丙醇分别离心沉淀，去除杂蛋白、脂质及核酸，再用提取液B溶解包涵体，用稀释液C稀释使目的蛋白析出，分离后将沉淀物用缓冲液洗涤，并用溶解液溶解，获得纯度大于82％的内皮抑素包涵体；(2)向步骤(1)获得的纯度大于82％的内皮抑素包涵体当中缓慢滴入复性液D进行复性，然后超滤浓缩，再用阴离子交换树脂和阳离子交换树脂进行分离纯化，获得纯度为96％以上的重组人内皮抑素蛋白。