processo de obtenção de um inibidor de proteases do tipo kunitz a partir de uma biblioteca de cdna de glándulas salivares do carrapato amblyomma cajennense: sequência de oligonucleotìdeos do clone, e sequência de aminoácidos da proteìna recombinante, proteìna recombinante; processo para determinação da atividade inibitória sobre o fator x ativado, processo para determinação da atividade anticoagulante em plasma, processo para determinação da atividade apoptótica em linhagens de células tumorais humanas e murinas, processo de determinação de atividade anti-metastática em tumor de melanoma, processo de determinação da atividade anti-cáncer, in vitro e in vivo, uso do recombinante em diferentes mecanismos homeostáticos (coagulação e resposta imunológica), anti-proliferativos, anti-apoptóticos e anti-angiogênicos

摘要

"PROCESSO DE OBTENçãO DE UM INIBIDOR DE PROTEASES DO TIPO KUNITZ A PARTIR DE UMA BIBLIOTECA DE CDNA DE GLáNDULAS SALIVARES DO CARRAPATO AMBLYOMMA CAJENNENSE: SEQüêNCIA DE OLIGONUCLEOTìDEOS DO CLONE, E SEQüêNCIA DE AMINOáCIDOS DA PROTEìNA RECOMBINANTE, PROTEìNA RECOMBINANTE; PROCESSO PARA DETERMINAçãO DA ATIVIDADE INIBITóRIA SOBRE O FATOR X ATIVADO, PROCESSO PARA DETERMINAçãO DA ATIVIDADE ANTICOAGULANTE EM PLASMA, PROCESSO PARA DETERMINAçãO DA ATIVIDADE APOPTóTICA EM LINHAGENS DE CéLULAS TUMORAIS HUMANAS E MURINAS, PROCESSO DE DETERMINAçãO DE ATIVIDADE ANTI-METASTáTICA EM TUMOR DE MELANOMA, PROCESSO DE DETERMINAçãO DA ATIVIDADE ANTI-CáNCER, IN VITRO E IN VIVO, USO DO RECOMBINANTE EM DIFERENTES MECANISMOS HOMEOSTáTICOS (COAGULAçãO E RESPOSTA IMUNOLóGICA) , ANTI-PROLIFERATIVOS, ANTI-APOPTóTICOS E ANTI-ANGIOGêNICOS". Trata-se a presente invenção de um inibidor recombinante do tipo Kunitz que foi obtido a partir de um gene clonado de uma biblioteca de cDNA das glandulas salivares do Amblyomma cajennense, e o inibidor denominado Amblyomin-X apresenta massa molecular da ordem de 13.500 Da. O Amblyomin-X quando testado sobre o FXa utilizando o substrato colorimetrico especifico para o FXa, inibe o FXa e a inibição mostrou-se dependente da presença de fosfolipideos (Fosfatidilserina : Fosfatidilcolina). A atividade inibitória do Amblyomin-X foi verificada também nos testes de coagulação, sendo avaliados o tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPA ), o tempo de protrombina (TP) e o teste PCA - pro coagulant activity assay. A presença de 7,5 uM do inibidor prolonga cerca de 3 vezes TTPA; aproximadamente 6 vezes o TP, e também prolonga cerca de 2 vezes o PCA, sendo que este ensaio foi realizado tanto na presença de fosfatidilserina : fosfatidilcolina como na presença de corpos apoptóticos (produzidos a partir de células CHO) como fonte de fosfolipídeos. O tratamento in vitro das linhagens tumorais B16F10, SW12A1, B3, L292, MCF7, HL60, K562, U937 e JURKAT com o Amblyomin-X demonstrou que o inibidor exerce um efeito apoptótico de maneira tempo e dose dependente nestas células. Nenhum efeito foi observado em células normais de fibroblastos humanos, macrófagos, neutrófilos e linfócitos. Camundongos (C57BL/6J) portadores de melanomas dorsais que receberam Amblyomin-X (1mg/kg) durante 12 dias apresentaram redução significativa da massa tumoral e do número de metastases quando comparados a um grupo de animais portadores do tumor e não tratados. Além disso, camundongos (C57BL/6J) portadores de metastases no pulmão, que foram tratados com Amblyomin-X (1mg/kg) durante 12 dias apresentaram redução no número de nódulos tumorais no parênquima pulmonar quando comparados a um grupo com tumor não tratado. O tratamento, por via subcutânea, de camundongos (C57BL /6J) portadores de melanoma, com 42 doses de Amblyomin-X (1mg/kg), mostrou que o inibidor é capaz de fazer a remissão completa do tumor, impedir metastases e não causar alterações hematológicas nos animais, mantendo o hemograma semelhante ao de um grupo de animais sadios. A análise do ciclo celular dos tumores dorsais de animais tratados com Amblyomin-X mostrou uma grande parte das células tumorais em apoptose, quiescentes e com baixa capacidade proliferativa. As células obtidas de metastases pulmonares encontram-se em grande parte na fase G2/M incapazes de se dividir. A atividade funcional de macrófagos obtidos de animais portadores de tumor dorsal e tratados com Amblyomin-X mostrou que a droga aumenta a capacidade fagocitária destes macrófagos mediada por C3B e pelo receptor FC. Assim, o Amblyomin-X além de um inibidor do FXa, também é eficaz no tratamento alvo de neoplasias malignas.