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1、一种中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法，包括下列步骤：一、输卵管分泌细胞的培养基的制备：包括基础培养基、条件培养基；选择适合中国林蛙输卵管分泌细胞的基础培养基有DMEM/Ham’sF12、F10/DMEM或RPMI1640，将上述培养基每份定溶于1000ml四馏水中，再补加抗生素其中青霉素10万单位/L、链霉素100mg/L，培养基用0.22μm滤膜滤过除菌，调整pH为7.4-7.6备用；条件培养基，包括作为营养物质的新生牛血清和添加的促生长类激素，其中新生牛血清为每100mL上述基础培养基中加入5～15ml，胰岛素为5～10mg/L基础培养基；10-6mol/L的雌二醇为5～10μl/ml基础培养基；二、输卵管分泌原代细胞的获取：无菌采取输卵管，采用直接剪切法解离细胞，从而减小对细胞的损伤程度且为体外存活提供更好的前提条件；三、输卵管分泌原代细胞的培养：将获取得原代细胞加入含15％新生牛血清培养液制成细胞悬液，经台盼蓝染色行细胞计数，调整细胞浓度为2×105～5×105个/ml接种于6孔培养皿中，每孔加入细胞悬液3ml，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养，每3～4天换一次培养液；四、输卵管分泌细胞的传代培养：待原代细胞长满单层后，即可进行传代，吸去培养皿中原培养液，用基础培养液洗涤细胞1-2次，洗去残留的血清成分，加0.125％或0.25％胰蛋白酶2ml或0.02％乙二胺四乙酸二钠3ml，放入37℃温箱中消化5-10分钟，倒置显微镜下观察贴壁细胞收缩变圆即可吸去消化酶液，加入含15％血清终止液终止消化，弃终止液，加入基础培养液，吹打制成细胞悬液，调节细胞数为105～2×105个/ml接种于新培养皿中，完成一次传代。 |
