一种基于褪黑素受体2分子探针的药物活性成分筛选方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种基于褪黑素受体2分子探针的药物活性成分筛选方法，包括了构建的褪黑素受体2分子探针和建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-In T-Rex HEK293细胞系，采用荧光共振能量转移的方法建立了褪黑素受体2分子探针，该分子探针具有高灵敏度，低噪音，高通量的特点，不仅能筛选受体激动剂也能筛选拮抗剂/反向激动剂，并且筛选过程不收下游信号的干扰；经过合理设计的分子探针能够对中药混合物进行筛选，能一步到位的在受体水平上筛选到分子作用靶点明确的先导化合物。

主权项

一种基于褪黑素受体2分子探针的药物活性成分筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括了以下步骤：步骤1:构建的褪黑素受体2分子探针:A.用PCR的方法将VSV‑G tag及限制性内切酶位点分别引入人褪黑素的cDNA的5’端,并用Overlapping PCR法将eCFP的cDNA连接到受体cDNA的3’端，将“受体‑eCFP”连接到pcDNA5/FRT/TO载体，从而得到pcDNA5/FRT/TO‑VSV‑受体‑eCFP质粒；B.用突变法将eYFP荧光基团的cDNA接入质粒中受体第三内环中，从而得原始的分子探针质粒；C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时,以表达受体分子探针，并用市售的受体激动剂激活探针，用Olympus高速荧光显微镜监测探针的灵敏度；D.根据探针灵敏度的监测结果，对探针进行结构优化；步骤2：建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp‑InT‑Rex HEK293细胞系：A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp‑InT‑Rex HEK293细胞,并用200ug/mlHygromycin筛选阳性细胞克隆；B.用1ug/ml Doxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针，用VSV抗体检测探针蛋白的表达，用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位；C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp‑InT‑Rex HEK293细胞，得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线，并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。