同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片

摘要

本发明涉及同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片。本发明仅用100μl脑脊液即可实现多种疱疹病毒、肠道病毒核酸同时提取、扩增和检测，所需样本量少，提取快捷，扩增效率高，结果可靠，特异性强，可以实现对上述病毒引起的临床病毒性脑炎、脑膜炎的早期诊断和治疗，解决了目前临床脑脊液中病毒检测的瓶颈问题。

主权项

一种同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的系统，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片；其特征在于：所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中的引物由Biotin‑HHV1,2,4,5‑f、HHV1,2,5‑r、HHV4‑r、Biotin‑EV‑f和EV‑r五种引物混合，核苷酸序列分别如下：HHV1,2,4,5‑f: 5´‑ TCATCTACGGGGACACGGAC ‑3´；HHV1,2,5‑r:   5´‑ CGCACCAGATCCACGCCCTT ‑3´；HHV4‑r:       5 ´‑ GAGCTCCACCCCCTTCATC ‑3´；EV‑f:         5 ´‑ ttaaaacagcctgtgggttg ‑3´；EV‑r:         5 ´‑ tgactcatcgacctgatctaca ‑3；其中HHV1,2,4,5‑f为扩增HSV1、HSV2、EBV、CMV的上游引物；HHV1,2,5‑r为扩增HSV1、HSV2、CMV的下游引物；HHV4‑r为扩增EBV的下游引物；Biotin‑HHV1,2,4,5‑f和Biotin‑EV‑f为在两条上游引物HHV1,2,4,5‑f和EV‑f的5’端添加生物素Biotin作为标记物；所述的特异性探针分为肠道病毒特异性探针和人类疱疹病毒特异性探针，肠道病毒特异性探针序列如下：EV71‑P: GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA；CA16‑P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG；CB5‑P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG；人类疱疹病毒特异性探针序列如下：HSV1‑P: GGCACAGCACAAAGATGGA；HSV2‑P: GGCACAAAACGAAAATGGA；HHV3‑P: GTTTGTTATGACGGCCGAG；HHV5‑P: ACGAAAGCGGACAAACACG；所述核苷酸提取试剂盒中的提取裂解液，每百毫升组分如下：硫氰酸胍47.264 g，N‑月桂酰肌氨酸0.5 g，二硫苏糖醇15.425 mg，柠檬酸钠736.25 mg，糖原10 mg，DEPC‑ddH₂O加至100 ml；所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒，反应体系如下：5×RT Buffer 2 µl，RT Enzyme Mix 0.5 µl，2µM特异性逆转录引物0.5µl，核酸模板2µl，DEPC‑ddH₂O 加至10µl；所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中，PCR扩增反应体系如下：10×PCR Buffer 1.5µl，每种浓度均为10mM的dNTP 0.4µl，10mM的MgCl₂ 0.6µl，混合引物10.4µl，PCR模板1.0µl，Taq聚合酶0.5µl，加ddH₂O至15µl；所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒中的特异性逆转录引物序列如下：EV‑r:5 ´‑ tgactcatcgacctgatctaca ‑3´。