启动子活性的检测方法

摘要

本发明涉及一种启动子活性的检测方法，包括：农杆菌侵染植物胚；共培养至少2天；GUS鉴定。本发明启动子活性的检测方法仅需要对植物胚（特别是玉米胚）共培养3天，无需经历数星期甚至数月的组织培养过程，便可通过GUS染色分析和/或GUS蛋白含量测定对启动子活性进行鉴定，避免了玉米基因型转化特异性、诱导分化和生根难等环节，节省了时间，提高了筛选效率，降低了生产成本，同时实验结果直观、准确。

主权项

一种启动子活性的检测方法，其特征在于，包括：农杆菌侵染植物胚；共培养至少2天；GUS鉴定，具体地，包括如下步骤：从玉米中分离未成熟的幼胚，用包含启动子序列的农杆菌悬浮液接触幼胚，使农杆菌能够将待测启动子传递至幼胚之一的至少一个细胞，幼胚与农杆菌共培养3天，其中，幼胚在侵染步骤后在固体培养基上培养，所述的固体培养基为MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮100mg/L、2,4‑二氯苯氧乙酸1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8；对转入启动子序列的玉米胚的蛋白提取液进行GUS活性测定，具体步骤如下：步骤1、分别称取转入启动子序列的玉米胚和正对照玉米胚各20mg，加入500μl提取缓冲液在研钵中研成匀浆，所述的提取缓冲液为pH7.0的50mMNaPO₄、1mM二硫苏糖醇、10mM EDTA、0.1％十二烷基肌氨酸钠、0.1％聚乙二醇辛基苯基醚；步骤2、在温度4℃、转速4000rpm下离心10min后，收集上清液，并置4℃下保存；步骤3、在250μl 37℃，至少30min预热的反应缓冲液中加入50μl所述上清液，混匀，所述的反应缓冲液为pH7.0的50mM NaPO₄、1mM二硫苏糖醇、10mM EDTA、0.1％十二烷基肌氨酸钠、0.1％聚乙二醇辛基苯基醚、1mM 4‑甲基伞形酮酰‑β‑葡萄糖苷酸，于温度37℃下反应15min后，取出30μl加入到270μl质量/体积为2％的碳酸钠反应终止液中终止反应；步骤4、制作4‑MU的标准曲线，用SpectraMax M2测定各样品的Ex365/Em455值；步骤5、取所述上清液30μl，用水定容至360μl，取出30μl后加入100μl BCA反应物，于温度37℃下反应30min后，再于室温下冷却10min；步骤6、同时以牛血清白蛋白制作标准曲线，用SpectraMax M2测定各样品的560nm光吸收值。