一种荧光标记探针的PCR－LDR基因多态性检测测序方法

摘要

本发明提供一种荧光标记探针的PCR－LDR基因多态性检测测序方法。本发明利用荧光标记探针进行PCR关联LDR和测序技术来进行基因多态性位点检测。本发明方法包括以下步骤：引物和探针设计、PCR检测、LDR检测、测序仪结果检测。本发明的方法由于测序结果的直接性，解决了结果的假阳性和假阴性；测序平台的样本高通量性，可同时进行上百例样本的检测；位点的高通量，利用测序仪的5色荧光检测系统，同时能利用4种荧光，使测序仪系统也可同时进行一百多个位点的检测，加速检测的速度，降低了实验成本。

主权项

1、一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性检测测序方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(一)探针设计(1)针对检测的位点，设计一系列LDR产物的分子量系列；(2)设计一个专有荧光标记探针，该探针具有极高的特异性，与已知生物的序列无同源性；(3)设计一个专有模板，该模板具有极高的特异性，与已知生物的序列无同源性；(4)在标记探针的3’端和检测探针的5’端引入随机序列来调整探针长度；(二)PCR检测取待检测DNA 1μl，PCR引物各10-30pmol，高温聚合酶，高温聚合酶混合液，相互混合，PCR反应条件为：94℃30秒，40-68℃30秒-2分钟，60-72℃45秒-2分钟，循环25-40次；(三)LDR检测取PCR产物1μl，探针各40fmol-10pmol，连接酶，连接酶缓冲液，相互混合，LDR反应条件为：94℃ 30秒，40-70℃(优选45-60℃)1-10分钟，循环1-40次；(四)结果检测取LDR产物1-5μl，混合测序系统的loading buffer，测序仪上样，进行LDR产物分离鉴定。