一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法

摘要

本发明属于DNA生物合成领域，具体涉及一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针方法及其应用，可用于检测小的非编码核糖核酸，如微核糖核酸,包括如下步骤：（1）制备重组有模板DNA的质粒；（2）切割并连接模板DNA，从重组质粒上酶切获得模板DNA，使模板DNA首尾连接成环；（3）切单链，滚环复制，用切口酶切断模板DNA的一条链，加入聚合酶以环状带切口的DNA为模板进行滚环复制，扩增出含颈环-探针结构的DNA单链；（4）目的短单链DNA的制备，对步骤（3）的产物采用Ⅱ型内切酶切割形成目的单链DNA探针和副产物DNA，通过PAGE分离纯化得到无突变的单链DNA探针。本发明在小非编码RNA检测领域和小非编码RNA相关疾病的诊断和治疗领域具有广泛用途。

主权项

一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备重组有模板DNA的质粒设计模板DNA序列：模板DNA为双链，两端含有相同的酶切位点；模板DNA设有至少一个颈环‑探针结构，所述颈环为含内切酶位点的可成环结构，所述探针为与任一微RNA完全互补的单链DNA探针；模板DNA还带有切口酶位点；合成所述的模板DNA并连接至质粒中，经测序验证无突变并扩增；(2)酶切并连接模板DNA从重组质粒上酶切获得模板DNA，使模板DNA首尾连接成环；(3)切单链，滚环复制用切口酶切断模板DNA的一条链，加入phi29DNA聚合酶以环状带切口的DNA为模板进行滚环复制，扩增出含颈环‑探针结构的DNA单链；(4)目的短单链DNA的制备对步骤(3)的自发形成颈环二级结构的DNA单链产物采用内切酶切割，在颈环和DNA探针序列之间切断，形成与微RNA完全互补的目的单链DNA探针和副产物DNA，通过PAGE分离纯化得到含单一序列的无突变的单链DNA探针。