一种超高效液相色谱-串联四级杆质谱同时测定中药中100种农药残留的方法

摘要

本发明提供了一种超高效液相色谱-串联四级杆质谱同时测定中药中100种农药残留的方法。中药材粉末用超纯水浸泡，用含0.1％乙酸的乙腈匀浆法提取，N-丙级乙二胺和石墨化碳固相分散净化，用超高效液相色谱-串联质谱在分时段多反应监测模式下检测，外标曲线法定量。88％的农药在5-500ng/mL范围内线性关系好，相关系数在0.99以上，98％的农药相关系数在0.97以上；农药在低浓度为10μg/kg、中浓度为50μg/kg、高浓度为100μg/kg的回收率平均值在70％-130％，相对标准偏差小于0.15；检出限≤0.01mg/kg，完全满足常规检测要求。该方法通用性强、选择性好、灵敏度高、快速简便。

主权项

一种超高效液相色谱‑串联四级杆质谱同时测定中药中100种农药残留的方法，其特征在于，步骤如下：[1]农药标准品储备液的制备：分别称取100种农药标准品各10mg置于10mL容量瓶中，选择乙腈、甲醇或丙酮分别溶解农药标准品并定容至刻度，使100种农药标准品储备液的浓度均为1000μg/mL，农药标准品储备液‑18℃保存；[2]农药混合标准品溶液的制备：将上述100种农药标准品储备液分别取出，然后混合到一起，用乙腈定容，制备农药混合标准品溶液，其中，每种农药标准品在农药混合标准品溶液中的浓度分别为：①浓度为0.1μg/mL的农药为：3‑羟基克百威、磷酸三苯酯、阿特拉津、百治磷、保棉磷、倍硫磷亚砜、苯醚甲环唑、苯线磷、吡蚜酮、丙环唑、残杀威、虫酰肼、稻瘟灵、敌百虫、敌稗、敌草胺、丁胺磷、定菌磷、毒虫畏、对嘧菌环胺、多菌灵、丰索磷、伏杀硫磷、氟磺胺草醚、甲胺磷、甲基嘧啶磷、甲基内吸磷、甲基异柳磷、甲硫威、甲萘威、甲霜灵、腈菌唑、久效磷、抗蚜威、克百威、喹禾灵、喹硫磷、乐果、磷胺、硫双威、咯菌腈、氯唑磷、马拉硫磷、马拉氧磷、猛杀威、嘧啶磷、嘧菌酯、灭多威、灭菌磷、灭克磷、噻虫嗪、三唑磷、三唑酮、杀虫畏、杀铃脲、杀扑磷、霜霉威、速灭磷、速灭威、涕灭威砜、戊唑醇、西玛津、辛硫磷、氧化乐果、氧皮蝇磷、乙草胺、乙霉威、乙酰甲胺磷、异丙甲草胺、异丙威、异稻瘟净、益棉磷、茚虫威、蝇毒磷、增效醚、治螟磷、仲丁威；②浓度为1μg/mL的农药为：胺丙畏、倍硫磷砜、苯硫磷、吡虫啉、丙溴磷、虫螨畏、毒死蜱、甲拌磷、甲基立枯磷、甲基托布津、氯苯嘧啶醇、三唑醇、特谱唑、乙嘧硫磷；③浓度为2μg/mL的农药为：稻丰散、敌敌畏、啶虫脒、恶唑禾草灵、二嗪磷、氟菌唑、甲草胺、甲基毒死蜱、霜脲氰；[3]中药材前处理液的制备：①将待检测的中药材饮片粉碎，过9号筛，得到待检测的中药材样品粉末，置干燥器中储存；②取2.00g待检测的中药材样品粉末，加入10mL超纯水，混匀后放置1小时，加入10mL乙酸体积分数为0.1％的乙酸乙腈混合液用涡旋振荡器涡旋提取1min；③向上述提取物中加入4g无水硫酸镁与1g氯化钠的混合物，继续涡旋提取1min；④在4℃下，3500rpm离心10min；⑤放置至室温时取出7mL提取液，加入混合吸附剂净化，振荡1‑2min,3500rpm离心10min；⑥移取5mL上清液，用氮气吹干，用含甲酸体积分数为0.1％的甲醇和水混合溶液定容至1mL，甲醇和水质量比为3:2，过0.2μm滤膜，得到中药材前处理液，待检测；所述的混合吸附剂的加入量及组成为：1.05g无水硫酸镁，210mgN‑丙级乙二胺(PSA)，70mg石墨化碳(GCB)；[4]基质混合标准品溶液的制备：取检测的不含农药残留的中药材样品粉末5份，每份为2.00g，均用上述的步骤[3]的①至⑤进行处理；在所述的⑥，移取5mL上清液，分别加入步骤[2]制备的农药混合标准品溶液，使得到的溶液中的农药混合标准品溶液中浓度为0.1μg/mL的每种农药的最终浓度分别为5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg，均用氮气吹干，分别用甲酸体积分数为0.1％的甲醇和水混合溶液定容至1mL，甲醇和水体积比为3:2，过0.2μm滤膜，得到5份待检测的基质混合标准溶液；[5]中药材前处理液的检测：将步骤[3]得到的中药材前处理液用自动进样器进样，进样体积5μL，利用超高效液相色谱对待测的100种农药进行分离后，在电喷雾(ESI)电离源正、负离子多反应监测模式下对中药材前处理液进行测定；[6]超高效液相色谱的检测条件如下：超高效液相色谱仪：美国Waters ACQUITY UPLC；色谱柱：美国Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱，规格为1.7μm，2.1×100mm；流动相A为乙腈，B为甲酸的体积分数为0.1％的水溶液；流速：0.3毫升每分钟；柱温：35℃；梯度：0分钟‑1分钟A为5％‑10％，1‑4分钟A为10％‑30％，4‑8分钟A为30％‑60％，8‑13分钟A为60％‑90％，13‑14分钟A为90％‑70％，14‑15分钟A为70％‑5％；[7]质谱检测条件如下：质谱仪：Waters Xevo TQ；电喷雾离子源，正、负离子同时扫描，多反应监测模式，毛细管电压3.20kV，离子源温度150℃，脱溶剂气为氮气，温度为500℃，干燥气流速800L/Hr，碰撞气为氩气，氩气流速为0.16mL/min；[8]标准曲线与基质校准曲线：吸取上述步骤[2]的农药混合标准品溶液，制成农药混合标准品溶液中浓度为0.1μg/mL的每种农药的浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的农药混合标准品溶液，分别进样5μL，用超高效液相色谱‑串联质谱进行分析，记录各待测组分MRM色谱峰面积，以各成分的浓度为横坐标X，各成分的峰面积为纵坐标Y，进行回归分析，可得到100种农药的线性回归方程，每个线性回归方程都可以做出一条曲线，即标准曲线；由此标准曲线判断100种农药的线性范围，农药的标准曲线均由仪器软件自动给出；所述的线性范围指的是标准曲线为直线的农药的浓度范围；为消除中药材前处理液中化学成分对测定的影响，用基质校准曲线代替标准曲线进行定量分析；取上述步骤[4]的基质混合标准溶液，分别进样5μL，用超高效液相色谱‑串联质谱进行分析，记录各待测组分MRM色谱峰面积，以各成份的浓度为横坐标X，各成份的峰面积为纵坐标Y，进行回归分析，得到100种农药的线性回归方程；此线性回归方程对应的曲线为基质校准曲线，此曲线可用于定量分析；[9]灵敏度实验：灵敏度实验包括仪器的灵敏度和方法的灵敏度，仪器的灵敏度用仪器的检出限表示，方法的灵敏度用方法的定量限表示；将步骤[2]制备的农药混合标准品溶液用体积分数为60％甲醇的水溶液逐级稀释，并分别进样分析，测定信噪比，取信噪比≥3的农药混合标准品溶液的最小浓度作为仪器检测限；将步骤[2]制备的农药混合标准品溶液用中药材前处理液逐级稀释，并进样分析，测定信噪比，取信噪比≥10的农药混合标准品溶液的最小浓度作为方法定量限；[10]准确性及重复性实验：取不含农药残留的中药材粉末9份，每份为2.00g，每3份分别加入浓度为1μg/mL的步骤[2]制备的农药混合标准品溶液200μL、100μL、20μL；按照上述步骤[3]制备中药材前处理液，并进样分析，计算回收率及相对标准偏差；所述的准确性用回收率来表示，重复性用相对标准偏差来表示。