一种番茄遗传转化的方法

摘要

本发明涉及一种番茄遗传转化的方法，属于遗传工程技术领域，具体的说公开了一种番茄种子整体侵染的方法，该方法包括测成熟番茄种子的生理吸胀曲线；含有目标基因的发根农杆菌培养；结合番茄种子的生理吸胀曲线，将消毒灭菌的番茄种子转入到OD₆₀₀值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时；在25℃黑暗条件下共培养3天；抗性植株的筛选；抗性植株的生根及培育；转化植株炼苗及移栽等步骤。本发明由于采用在番茄种子吸胀阶段用发根农杆菌菌液侵染，大大提高了转化效率，经过压力筛选培养基进行筛选，缩短了实验周期2-3个月，简化了实验过程，减少了转化后的鉴定工作量。对番茄基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有重要意义。

主权项

一种番茄遗传转化的方法，该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的，其特征在于：步骤包括： ①测成熟番茄种子的生理吸胀曲线：取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取1份浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7‑9小时； ②含有目标基因的发根农杆菌培养：将发根农杆菌A4在LB固体培养基平板上接种活化2次，挑取该菌株的单菌落接种到5ml含有50μg·ml^‑1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26℃、振荡转速160‑200rpm的条件下，培养5‑8小时，然后取1ml转接于50ml含有50μg·ml^‑1卡那霉素和110μmol·L^‑1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26℃、振荡转速160‑200rpm的条件下，培养12‑16小时后，取50ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25℃、转速3500rpm条件下离心10分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含6mg·L^‑16‑BA和110μmol·L^‑1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD₆₀₀值为0.8‑1.3备用； ③番茄种子的消毒灭菌：挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5‑2小时，Cl₂灭菌20分钟，无菌水冲洗5‑6次，准备侵染用； ④结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD₆₀₀值为0.8‑1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7‑9小时：结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到装有步骤②制备的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，于26℃，166rpm条件下振荡培养7‑9小时； ⑤在25℃黑暗条件下共培养3天：待步骤④侵染7‑9小时后，从摇床中取出三角瓶置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次后，置于共培养培养基上，25℃黑暗条件下，共培养3天；共培养的培养基是指：在MS培养基中加入6mg·L^‑16‑BA和110μmol·L^‑1乙酰丁香酮和7g·L^‑1琼脂，pH值5.80‑5.82； ⑥抗性植株的筛选：将经步骤⑤共培养的种子，转接到压力筛选培养基上培养1.5‑2个月，获得抗性植株；压力筛选培养基是由1/2MS培养基中加入0.2mg·L^‑16‑BA和1mg·L^‑1IBA和250mg·L^‑1Cef和50‑100mg·L^‑1Kan组成； ⑦抗性植株的生根及培育：将步骤⑥筛选之后成活的抗性植株接种在生根培养基上进行生根及培育，置于光照强度为2000lx，光照时间为12day/8night的人工气候箱中培养20‑30天；生根培养基是由1/2MS培养基加入0.4g·L^‑1活性炭组成； ⑧转化植株炼苗及移栽：当步骤⑦获得的植株根长达到8cm左右时，置于温室内开盖2‑3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1‑2周内保持土壤湿度80％左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，在温室培养。