大麦原生质体制备及PEG介导转化方法

摘要

本发明涉及原生质体的培养技术，旨在提供一种大麦原生质体制备及PEG介导转化方法。该方法包括：大麦幼苗的培养、原生质体的制备，以及大麦原生质体的PEG介导转化过程，涉及酶液、W5试剂、PEG–Ca2+试剂、WI试剂的使用。与悬浮细胞体系相比，本发明以大麦幼苗为材料更加省时，省力。通过选取大麦幼苗的茎及叶片为材料，进行原生质体的的提取与转化，均能得到理想的转化效率，转化效率为70 %-80 %。

主权项

用于PEG介导转化的大麦原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）大麦幼苗的培养大麦种子经自来水中浸泡2 h后，用10％次氯酸钠表面消毒30 min，再用ddH₂O清洗8次；消毒后的种子平铺在湿滤纸上，25℃下萌发；36 h后，种子露白，选取长势良好的种子进行水培法培养：在pH 5.8的0.1mmol·L^‑1 CaCl₂培养液中，以8小时光照/16小时黑暗的条件于25℃培养5天后，得到用于原生质体提取试验的大麦幼苗；（二）原生质体的制备（1）首先配制酶液10ml和0.3M甘露醇10 ml；所述酶液的组份为：0.3 M的甘露醇、10 mM的MES、1.5%（wt/vol）的纤维素酶R10、0.75%（wt/vol）的离析酶R10、1mM的CaCl₂、0.1%（wt/vol）的BSA、1 mM的β‑巯基乙醇，余量为ddH₂O；（2）取50棵幼苗的茎段或5‑7片叶子于灭菌的滤纸上，用新的刀片将其切成0.5‑1 mm的薄片，切好后迅速加到有10 ml  0.3 M甘露醇的100 ml三角瓶中，以锡箔纸包好三角瓶，黑暗中放置10 min；（3）用移液器弃甘露醇，尽量吸净；加入10 ml酶液，锡箔纸包好三角瓶，放入真空罐中，抽真空条件200 psi以下，平板摇床上30转/分钟培养30 min；从真空罐中取出三角瓶，空气中平板摇床上30转/分钟，培养3.5 h；（4）加入等体积的W5试剂，平板摇床上40转/分钟，培养10 min；所述W5试剂的组份为：154 mM 的NaCl、125 mM 的CaCl₂、5 mM 的KCl 、2 mM 的MES ，余量为ddH₂O ；（5）用W5试剂润湿100目的细胞筛，过滤步骤（4）中的培养产物，滤液用50 ml圆底离心管收集，再用20ml W5试剂冲洗；（6）500 rcf常温离心3 min后，吸去上清；试管底部为绿色的一层原生质体；（7）加入2 ml W5试剂，轻柔摇晃离心管，使细胞悬浮；吸取细胞悬浮液至10ml圆底离心管中，锡箔纸包好使离心管避光，原生质体自然沉降30 min后，500 rcf离心3 min；移液器小心移去上清；留在圆底离心管底部的即为大麦原生质体。