一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法

摘要

本发明公开了一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，所述方法为：待筛选菌株依次接种到平皿培养基、斜面培养基、发酵培养基中培养，收集得到发酵液，取发酵液离心，取上清液用水稀释10-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入0.1U/ml的唾液淀粉酶30μl，5mmol/l的Gal-G2-α-CNP 40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl（50mmol/l，pH 6.0），40μl待测样品。对照组为用等体积的缓冲溶液代替待测样品。用酶标仪于405nm处检测Abs₄₀₅，每5秒钟读一次数，直至Abs₄₀₅不再增加。将Abs₄₀₅相对于对照组降低30%以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。本发明提供的筛选方法简单有效，可以在短时间内筛选大量样品，灵敏度高，提高了检测效率。

主权项

一种α‑淀粉酶抑制剂产生菌的鉴定方法，其特征在于所述方法为：（1）将待鉴定菌株接种到平皿培养基上，20～37℃培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，20～37℃培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖5‑30g/l,蛋白胨1‑5g/l，酪氨酸0.5‑2g/l，K₂HPO₄·3H₂O0.5‑2g/l，KCl0.5‑2g/l，MgSO₄·7H₂O0.5‑2g/l，FeSO₄·7H₂O0.1‑1g/l,琼脂15‑20g/l，溶剂为水，初始pH6.0‑7.5；（2）挑选步骤（1）得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度25～37℃，摇床转速150～200rpm，培养1～7天，得到发酵液，取发酵液于4000～12000rpm离心，取上清液备用；所述发酵培养基的组成为：麦芽糖10‑120g/l，葡萄糖10‑50g/l，黄豆饼粉5‑25g/l，碳酸钙2‑10g/l，甘油2‑10g/l，谷氨酸钠2‑10g/l，溶剂为水，初始pH6.0‑7.5；（3）将步骤（2）获得的上清液用水稀释10‑100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml,每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5mmol/l的2‑氯‑4‑硝基苯‑α‑半乳糖‑麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol·L^‑1磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液90μl，40μl待测样品；对照组为：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml,5mmol/l2‑氯‑4‑硝基苯‑α‑半乳糖‑麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol·L^‑1磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液130μl，用酶标仪于405nm处检测Abs₄₀₅，每5秒读一次数，直至Abs₄₀₅不再增加，Abs₄₀₅相对于对照组降低30%以上的样品孔内即为α‑淀粉酶抑制剂产生菌。