一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法

摘要

本发明公开了一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。该序列是一种新的TPS基因序列，使人们对TPS基因的研究对象从大肠杆菌和真菌等微生物及少数有限的植物体进一步扩展到垫状卷柏等多种植物体。并且，根据该TPS基因在垫状卷柏植物体内催化合成的海藻糖所表现出的优良的抗旱、耐盐等性能可以预料：如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物的基因中，将可培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。本发明还公开了一种上述来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列的克隆方法。

主权项

1.一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。2、根据权利要求1所述的序列，其特征在于：所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。3、一种权利要求1所述的来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤：（1）总RNA的提取和纯化：采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物垫状卷柏叶片中提取得到纯化的垫状卷柏叶片总RNA；（2）中间片段的克隆：A、中间片段cDNA第一链的合成以上述步骤（1）纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligod (T) 18：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3′为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的cDNA模板；B、PCR扩增以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为cDNA模板，利用下述上游引物jf1和下游引物jx1，进行PCR扩增：jf1: 5′-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3′，jx1: 5′-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3′；扩增得到垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列；（3）3′端的克隆：以前述步骤（2）A中得到的cDNA第一链为模板，利用下述上游引物S1和下游引物AP2进行PCR扩增：S1:  5′-GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3′，AP2: 5′-TACGTACGGCATG ACAGTG-3′；扩增得到完整的3′端，通过克隆测序，得到3′端序列；（4）5′端的克隆：C、合成5′端的cDNA第一链：以上述步骤（1）纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以下述下游引物jx1和上游引物SMARTIIA Oligo为反转录引物，进行反转录：jx1: 5′- TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3′，SMARTIIA Oligo: 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′；合成得到反转录产物5′端的cDNA第一链；D、第一段PCR扩增：以前述步骤C所得反转录产物5′端的cDNA第一链为cDNA模板，利用下述下游引物A2和同源上游引物C1，进行5′端第一段PCR扩增：A2: 5′-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3′，C1：5′-ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3′；扩增得到的产物为cDNA 5′端第一段，通过克隆测序，得到5′端第一段的序列；E、第二段PCR扩增：以前述步骤C所得反转录产物5′端的cDNA第一链为cDNA模板，利用下述下游引物A5和上游引物P3，进行5′端第二段PCR扩增；A5: 5′-GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3′，P3: 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ ；扩增得到的产物为cDNA 5′端第二段，通过克隆测序，得到5′端第二段序列；（5）ORF的克隆和拼接：将上述步骤（2）所得中间片段序列、步骤（3）所得3′端序列、和步骤（4）所得5′端第一段序列和第二段序列进行拼接，得到的cDNA全长作为ORF扩增的cDNA模板；以下述上游引物ORF4和下游引物ORF5进行PCR扩增：ORF 4：5′-CCCAAGCTT(Hind)CCTCGAG(Xho)ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC -3′，ORF5: 5′-CGC GGATCC (BamH)ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3′；扩增得到的产物为完整开放阅读框，即垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。4、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，采用的RNA提取方法为Trizol法；纯化方法为DNA酶消化法。5、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（2）中进行PCR扩增时，扩增体系为：TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，cDNA模板               1 μL ，2×引物：jx1/jf1       0.5 μL ，ddH₂O                   8 μL ；扩增程序为：94℃，5min；94 ℃，30 s，55 ℃，45 s，72℃，1 min 30 s；30个循环；72 ℃，8 min；4℃保温。6、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（3）中进行PCR扩增时，扩增体系为：TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，cDNA模板                2 μL ，2×引物：S1/AP2        0.5 μL ，ddH₂O                      7 μL ；扩增程序为：94℃，3 min；94℃，30 s；55℃，45 s；72℃，1 min 30 s；33个循环；72℃，8 min；12℃保温。7、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（4）中进行第一段PCR扩增时，扩增体系为：TaqPlusPCR Master Mix  12 μL ，cDNA模板                   2 μL ，2×引物：A2/C1           0.5 μL ，ddH₂O                       5 μL ；扩增程序为：94℃，3 min；94℃，30 s；65℃，45 s；72℃，1 min 30 s ；2个循环；每两个循环递减2℃；94℃，30 s；55℃，45 s；72℃，1 min 30 s ；25个循环；72℃，8 min；12℃保温。8、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（4）中进行第二段PCR扩增时，扩增体系为：TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，cDNA模板                  1.5 μL ，2×引物：A5/P3         0.5 μL ，ddH₂O                   7.5 μL ；扩增程序为：94℃，30 s；72℃，2 min；5个循环；94℃，30 s；70℃，30 s；72℃，2 min ；5个循环；94℃，30 s；68℃，30 s；72℃，2 min ；25个循环；12℃保温。9、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（5）中进行PCR扩增时，扩增体系为：2×GC BufferⅠ、含Mg²⁺       10 μL ，2×引物：ORF4/ORF5           0.5 μL ，cDNA模板                       1 μL ，dNTP Mixture                    3.2 μL ，TaKaRa LA Taq                   0.2 μL ，ddH₂O                        4.6 μL ；扩增程序为：94℃，5 min；94℃，30 s；57℃，1 min 30 s；72℃，2 min ；10个循环；94℃，30 s；72℃，2 min 30 s ；25个循环；72℃，8 min；12℃保温。