一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法

摘要

一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了酿酒酵母中缺少木糖还原酶，不具备木糖代谢能力，不能有效发酵植物纤维水解液的问题。构建方法：先克隆XYL1基因、ADHt基因序列和KanR基因；再回收、纯化步骤一至三制备的基因片段，分别与载体连接；然后构建质粒pADH、质粒pAK；再将XYL1基因引入质粒pAK，即得到表达木糖还原酶基因的质粒。本发明方法将木糖还原酶基因XYL1和乙醇脱氢酶的强启动子的终止子序列构建于同一个质粒载体上，在增添了木糖代谢为乙醇的途径外，还抑制了木糖代谢为木糖醇，能够介导酿酒酵母高效代谢木糖生产乙醇。

主权项

一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行：一、克隆休哈塔假丝酵母菌的XYL1基因；二、克隆质粒pKT0150中的ADHt基因序列；三、克隆质粒pKT0150中的KanR基因；四、回收、纯化步骤一至三制备的基因片段，然后再分别与pGEMT Easy载体在16℃的条件下连接10～12h，得到pGMT-XYL1、pGMT-ADHt和pGMT-KanR；五、构建质粒pADH，以酿酒酵母整合质粒p406ADH1为骨架引入ADHt基因；六、构建质粒pAK，将KanR基因引入质粒pADH中；七、将XYL1基因引入质粒pAK，即得到表达木糖还原酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5’-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC-3’，下游引物序列为5’-TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3’；步骤二中扩增上游引物序列为5’-CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’，下游引物序列为5’-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’；步骤三中扩增上游引物序列为5’-TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列为5’-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步骤五中用限制性内切酶Xho I和Kpn I对质粒p406ADH1和pGMT-ADHt分别进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，得到质粒pADH；步骤六中用限制性内切酶Aat II对质粒pGMT-KanR和pADH分别进行单酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，得到质粒pAK；步骤七中用限制性内切酶Xba I和BamH I对质粒pAK和pGMT-XYL1分别进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，即得到表达木糖还原酶基因的质粒。