发明名称 |
pET-SOD工程菌的构建及其表达纯化方法 |
摘要 |
本发明公开了一种pET-SOD工程菌的构建及其表达纯化方法,本发明通过下述技术方案予以实现:设计引物从念珠藻CHEN(Nostoc commune strain CHEN)中克隆Fe-SOD基因,得到产物重组至质粒pUCm-T,并于大肠杆菌DH5α中克隆;设计引物扩增Fe-SOD基因,重组至原核表达载体pET22b(+),于大肠杆菌BL21构建成工程菌pET-SOD,并表达纯化出具超氧化物岐化酶活性和一定抗肿瘤能力的Fe-SOD。利用本方法构建的工程菌能在最佳条件下获得非常高效地表达,将解决工业上从动植物中提取SOD的原料限制问题。 |
申请公布号 |
CN1962871A |
申请公布日期 |
2007.05.16 |
申请号 |
CN200510061502.6 |
申请日期 |
2005.11.09 |
申请人 |
浙江大学 |
发明人 |
龚兴国 |
分类号 |
C12N15/53(2006.01);C12N1/21(2006.01);C12N9/08(2006.01) |
主分类号 |
C12N15/53(2006.01) |
代理机构 |
杭州中成专利事务所有限公司 |
代理人 |
唐银益 |
主权项 |
1、一种pET-SOD工程菌的构建方法,其特征依次包括以下步骤:(1)在BG11培养基中培养念珠藻CHEN(Nostoc commune strain CHEN)40~50天,取下层培养物,采用SDS-CATB法抽提念珠藻CHEN基因组;(2)以念珠藻CHEN基因组为模板,用TD-PCR方法扩增Fe-SOD基因,得到产物重组至质粒pUCm-T,重组质粒命名为T-SOD,并于大肠杆菌DH5α中克隆;TD-PCR所用的两种引物为:SOD-for:5’-GAGGATTTGACACGATGGCATTTG-3’SOD-orf:5’-CTGACACCTAATTAAGCTTTGGCC-3’;(3)以T-SOD为摸板,用PCR方法扩增Fe-SOD基因,经Nco I和Xhol I酶切点酶切后重组至相同酶切的表达质粒pET22b(+)上,SOD基因末端与6×His标签的基因序列相连,构建成pET-SOD;PCR所用的两种引物为:SODn:5’-CTAGCCATGGCATTTGTACAGC-3’,含Nco I酶切位点SODx:5’-CCGCTCGAGAGCTTTGGCCAAGTTTTC-3’,含Xhol I酶切位点;(4)将pET-SOD转移至大肠杆菌BL21中完成构建。 |
地址 |
310027浙江省杭州市玉古路20号 |