一种食品中大肠杆菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种食品中大肠杆菌的检测方法，采用等温扩增方法，以大肠杆菌colV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理；（2）构建等温扩增反应体系；（3）荧光定量反应；（4）检测分析。本发明的检测方法灵敏度高，特异性和敏感性强，对模板DNA要求较低，耗时短，方法简便。

主权项

一种食品中大肠杆菌的检测方法，其特征在于，采用等温扩增方法，以大肠杆菌colV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到LB培养基中，培养温度为38‑42℃，培养时间为20‑25h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取基因组DNA；（2）构建等温扩增反应体系：DNA模板 2μL，SYBER Green I荧光染料 0.1μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 15U，环糊精溶液 0.7μL，醋酸钠溶液0.5μL，dNTP 2μL，DNA引物 2μL，过氧化氢酶 2μL，透明质酸溶液 4μL，其余用dd H₂O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7‑1.9；所述SYBER Green I荧光染料为60‑65倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris‑HCl（pH 8.3）、蔗糖；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述环糊精溶液的浓度为15‑25mmol/L；所述醋酸钠溶液的浓度为30‑40mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7‑1.9；所述透明质酸溶液的浓度为20‑50mmol/L；（3）荧光定量反应：将等温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，92‑95℃变性1‑2min；63℃退火40s；71℃延伸1min；30个循环，最后72℃延伸10min；（4）检测分析：根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。