卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法

摘要

一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法，包括以下步骤：1）配制实验试剂；2）制备卷烟烟气总粒相物；3）细胞接种培养；4）卷烟烟气总粒相物染毒；5）样品处理及GSH/GSSG测定；6）结果分析。本发明应用SBB缓冲液重悬细胞，防止人为的氧化GSH，同时增加了样品的有效处理时间；考虑到细胞裂解液中存在活性巯基的蛋白质，为了减少非谷胱甘肽的硫化物与DTNB结合而干扰检测，在样品测定前，加入5-磺基水杨酸用于脱去样品中蛋白质，减少了测定过程中的干扰；由于本方法同时检测GSH和GSSG，在结果处理时应用了差减法，可分别得到GSH和GSSG浓度，本发明具有耗时短，操作简便，灵敏度高，结果可靠的优点。

主权项

一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：配制实验试剂：（1）生长培养液，（2）磷酸缓冲盐溶液（PBS），（3）1 %的胰酶，（4）三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（SBB），（5）掩蔽剂，（6）脱蛋白质剂，（7）GSSG标准溶液，（8）反应混合液，（9）还原型辅酶Ⅱ（NADPH）溶液，（10）阴性对照；制备卷烟烟气总粒相物；细胞接种培养；卷烟烟气总粒相物染毒；样品处理及GSH/GSSG测定：细胞孵育24 h后，吸去培养液，每孔加入1 mL 37℃预热的PBS洗一次, 经胰酶消化制得细胞团样品，细胞团样品在1.5 mL离心管中重悬于500 μL SBB缓冲液中，细胞超声破碎仪破碎细胞，功率300 W， 3 ~5秒/次，间隔10秒，重复3~5次；10000 g、4 ℃下离心10 min，收集上清液，加入v/v 5 %的5‑磺基水杨酸，混均，取50 μL加入1.5 mL离心管，并加入50 μL PBS 稀释，制得检测样品；取96孔板上两列孔，将样品以及标准品，一式两份，每孔50 μL, 加入相应孔内，空白孔加入50 μL PBS缓冲液；其中，用于检测GSSG的一列样品孔内加入掩蔽剂1 μL /孔，另一列样品孔用于检测总的GSH，不加入掩蔽剂；孵化1 min；样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入150 μL反应混合液，孵化2 min；样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入NADPH溶液50 μL；立即在412 nm下测定吸光值OD，每30 s记录一次OD值，记录3 min；结果分析：原始吸光值OD₀，反应t时间时检测的吸光值OD_t；反应t时间内吸光值的变化值ΔOD_t：ΔOD_t=OD_t‑ OD₀；所有检测孔内由相应的ΔOD_t做关于时间t的一次函数，其中斜率为该孔检测浓度下的ΔOD/min；所有检测孔的ΔOD/min，经空白对照ΔOD/min_(空白)校正为ΔOD/min_(校正)：ΔOD/min_(校正)=ΔOD/min—ΔOD/min_(空白)ΔOD1/min： GSH_(总)检测孔的ΔOD/min_(校正)ΔOD2/min： GSSG检测孔的ΔOD/min_(校正)以GSSG标准样品的ΔOD/min_(校正)和浓度，拟合标准曲线y = Ax + B样品中GSH/GSSG为： 。