一种茶、金花茶中茶多酚对食道癌标志物的筛选方法

摘要

本发明公开了一种茶、金花茶中茶多酚对食道癌标志物的筛选方法，由不同种类的茶、金花茶中提取制备茶多酚，茶多酚作用于体外培养的人食管鳞癌细胞与腺癌细胞OE33，采用MTT法检测茶多酚对食道癌细胞的增殖抑制作用，流式细胞检测茶多酚对食道癌细胞的分化诱导作用，观察细胞周期及凋亡效应；采用荧光倒置显微镜观察细胞形态学变化；应用免疫组化、Real-time荧光定量RT-PCR、Westem-blot分析食道癌细胞中蛋白表达变化。采用SPSS1统计对上述检测结果进行分析，并检测茶、金花茶中茶多酚作用食道癌细胞后的差异表达蛋白，经数据库检索匹配，筛选出相关蛋白。本发明中通过对差异表达蛋白作茶多酚作用的标志物分子的研究可以阐明其作用的机制。

主权项

一种茶、金花茶中茶多酚对食道癌标志物的筛选方法，其特征在于，具体步骤包括：1）应用XDA大孔树脂吸附纯化法由不同种类的茶、金花茶中提取制备茶多酚，其步骤包括：茶、金花茶→粉碎过30目筛→用30%乙醇浸泡20min→微波萃取20min→提取液经中空纤维膜分离→旋转蒸发浓缩→过大孔树脂XDA‑200柱→水洗脱除杂→10%乙醇洗脱除杂→30%乙醇梯度洗脱→洗脱液分别旋转蒸发浓缩→冷冻干燥→得到干燥粉末；茶多酚含量按“GB/T 8313‑2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法”方法测定，茶多酚含量=（试样粉末中茶多酚质量/试样质量）×100%；2）体外培养的人食管鳞癌细胞KYSE‑510、EC9706、KYSE‑ 510、EC9706、EC8712、EC8733、EC9706、Eca109以及腺癌细胞OE33为模型，上述细胞均贴壁生长于RPMI 1640培养基中，在37℃、5％的CO₂、饱和湿度下传代培养；实验分为茶多酚组、阳性对照组、溶剂对照组和空白对照组，其中茶多酚组中茶多酚各剂量组分别为10、20、40、60和80mg/m1；阳性对照组中氟尿嘧啶用药剂量为0.25mg/m1；溶剂对照组加入终浓度为0.1％的DMSO；空白对照组仅加入等体积培养液，不加药物和细胞；3）检测茶多酚对食道癌细胞的作用a)采用MTT法检测茶多酚对食道癌细胞的增殖抑制作用，具体步骤包括取对数生长期人食管鳞癌细胞KYSE‑510、EC9706、KYSE‑510、EC9706、EC8712、EC8733、EC9706、Eca109以及腺癌细胞OE33，经质量百分比浓度为0.25％的胰酶消化，接种于96孔培养板内，5×10³个细胞/孔，预培养24h，待细胞贴壁后吸出全部上清，按实验分组加入不同浓度的各种受试物，总体积200μl/孔，每一剂量组设4个复孔；分别培养24、48、72和96h，每孔加入20μl浓度为5mg/L的MTT，继续培养4h，弃去培养液，每孔加200μl的DMSO，平板摇床摇震10min，以DMSO调零，用酶联免疫检测仪以490nm波长测定各孔吸光值A，计算平均A值、增殖率PR及抑制率CIR；增殖率PR=(实验组A值/溶剂对照组A值)×100%；抑制率CIR=(1‑试验组平均A值/对照组平均A值)×100％；运用曲线回归分析，求出剂量反应关系方程及回归系数；b)根据MTT比色法的结果，选取合适的浓度按照实验设计处理细胞；取对数生长期的食道癌细胞，调整密度2.5×10⁴个/ml，置28cm²培养瓶中，培养24h待细胞贴壁后加入不同浓度处理因素，于96h终止培养；取EC9706、KYSE‑510或OE33细胞，弃去培养液，质量百分比浓度为0.25％的胰酶消化，2000r/min离心l0min，弃上清液，将细胞沉淀重悬于PBS液中，调整细胞密度至1×10⁶个/m1，2000r/min离心l0min，弃上清液；快速加入4℃预冷的75％乙醇1ml，使细胞重悬，4℃下保温10‑15h；取单细胞悬液lml，加入l0μg/ml的荧光染料碘化丙啶10μl和l0mg/ml的RNA抑制剂5μl，轻微振荡、室温下避光孵育20min，以400目筛网过滤，取细胞悬液在488nm波长下，用流式细胞仪进行细胞DNA含量检测；经Muticycle AV软件处理获取数据，对细胞周期各时相分布百分比进行分析，计算细胞周期中G_o/G₁期、S期和G₂/M期细胞在总数中所占的百分比，以增殖指数PI表示细胞的增殖活性；c)采用荧光倒置显微镜观察细胞形态学变化：将各细胞接种于96孔板内，5×10³个细胞/孔，预培养24h，各实验组分别加入10、20、40、60和80mg/m1的茶中茶多酚活性提取物，于溶剂对照组、阳性对照组分别培养24、48、72和96h，苏木精‑伊红染色法染色涂片后于荧光倒置显微镜下观察；d)应用免疫组化、Real‑time荧光定量RT‑PCR、Westem‑blot分析食道癌细胞中蛋白表达变化，三株食道癌细胞接种于9孔细胞培养板中，培养24h，经80μmol/L的茶多酚作用24h后，每5‑10×10⁶细胞加1ml的Trizol试剂，15‑30℃作用15min，弃上清液，向沉淀物中加0.5ml异丙醇/ml Trizol试剂，15‑30℃作用10min，2‑8℃，12000转离心15min，弃上清液；再加入1ml的75%乙醇/mlTrizol试剂洗涤RNA，2‑8℃，7500转离心5min，弃上清液，得到的样品于‑80℃下保存；使用ABI/9700系统进行各基因PCR扩增反应，反应程序如下：95℃，10s；预变性：95℃，5s；60℃，34s；40个循环；各种基因的PCR反应均进行扩增产物的熔解曲线分析；各基因表达比较均采用β‑actin作为内参基因；后续采用Western‑Blot分析食道癌细胞中蛋白表达变化，三株食道癌细胞接种于9孔细胞培养板中，培养24h，经80μmol/L的茶多酚作用24h后，PBS液洗涤三次，加入冷的细胞裂解液冰上作用30min，刮取细胞于微量离心管上，4℃，14000转离心15min，吸取上清液，紫外分光光度计测定各样品总蛋白浓度，并调节浓度一致；样品经10‑12%聚丙烯酰氨凝胶电泳4h后，转印到硝酸纤维素膜上，100mA、20‑60min；硝酸纤维素膜经封闭液封闭3h后，TBS缓冲液洗涤三次，于稀释比例1:500‑1:2000的第一抗体工作液中孵育2h；TBS缓冲液洗涤3次，稀释比1:2000的辣根过氧物酶标记的第二抗体工作液孵育2h，TBS缓冲液洗涤3次，超敏发光也显光，感光X光片后，显影定影，β‑actin蛋白作为内参蛋白；4）采用SPSS12.0统计软件对步骤3）中的结果进行分析，多样本均数间比较用单因素方差分析；两两比较用LSD检验；剂量反应关系用曲线回归和相关分析，检验水准α=0.05；5）检测了茶、金花茶中茶多酚作用食道癌细胞后的差异表达蛋白，获得双向电泳差异表达图谱，鉴定了差异蛋白的肽指纹图谱，经数据库检索匹配，筛选出了相关蛋白，所述相关蛋白包括异质性核内核糖核蛋白H1、泛素、微管去稳蛋白、PKC干扰蛋白1、异质性核内核糖核蛋白、高泳动性蛋白、微管蛋白分子伴侣、醛缩酶A。