高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法

摘要

高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物所得PCR产物进行等摩尔混合后作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行第二轮PCR反应，得到所需融合的目的基因。本发明为高GC含量DNA片段或以复杂结构DNA片段为模板的DNA片段重叠延伸PCR扩增，提供了有效的方法，解决了扩增中出现弥散带、非特异性条带、易发生突变的问题；具有耗时短、循环数少、操作简单的特点。

主权项

高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，其特征在于：其具体步骤包括：步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段，长度为22‑26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；然后采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5‑8个循环，得到两组PCR产物；步骤二、分别取步骤一中所得的两组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使两个DNA小片段连接成所需融合的全长基因。