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一种C反应蛋白标准物质定值的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)合成三条特异性肽段：ESDTSYVSLK、APLTKPLK、ALKYEVQGEVFTK用于进行C反应蛋白定量；(2)同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的三条同位素标记肽段；(3)以亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的三条标准肽段进行准确定量；(4)按400μL溶液中所含C反应蛋白质量，根据三条肽段的纯度计算酶切后所得三条目标肽段的质量，配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段；(5)准确称量400μL C反应蛋白溶液，加入并称量相应体积的同位素内标溶液；使酶切后所得目标肽段与内标肽段摩尔比为1:1；(6)离心干燥上述已加入内标的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液对蛋白进行变性处理；10min后加入2μL 1M的二硫苏糖醇溶液在60摄氏度水浴中加热60min；然后加入2μL 1M的碘乙酰胺，在暗处反应40min；加入6μL 1M的二硫苏糖醇还原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氢胺溶液稀释尿素至1M以下，加入2μL 0.5mg/mL的胰蛋白酶溶液进行酶切，每24小时补充2μL的胰蛋白酶；酶切96小时后采用同位素稀释质谱法对三条肽段进行准确定量；(7)根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例的标准曲线；计算溶液中肽段含量，根据蛋白的分子量计算每400μL溶液中C反应蛋白的浓度作为标准物质的定值结果。 |
