一种用于绵羊胚胎干细胞的无血清分离培养方法

摘要

本发明提供的一种用于绵羊胚胎干细胞的无血清分离培养方法，将体外培养的绵羊囊胚，采用Tyrode’s Solution去除透明带后，接种于绵羊胚胎干细胞无血清培养液中，并用针头固定，置于38.6℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，培养中每48小时半量更换培养液，pH为6.8-7.2，原代培养7-9天；之后每3-4天采用常规机械法按1∶2-1∶4传代一次，即绵羊胚胎干细胞体外培养可传至16代。绵羊胚胎干细胞无血清培养液的配制：D-MEM/F-12+80ng/mL bFGF+3μMCHIR99021+10μL/mL N2+20μL/mL B27+10μL/mL NEAA+2mM L-Glutamine+0.2mM β-Mercaptoethanol。使用32号针头将裸胚固定于培养皿底部，避免损伤囊胚内细胞团并将裸胚滋养层细胞剥离。裸胚接种数量因以45-60枚/组为宜。该方法能使绵羊的胚胎干细胞原代集落形成率提高至33％(14/42)。

主权项

一种用于绵羊胚胎干细胞的无血清分离培养方法，其特征在于：将体外培养的绵羊囊胚，采用Tyrode’s Solution去除透明带后，接种于绵羊胚胎干细胞无血清培养液中；用针头固定内细胞团，置于38.6℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，培养中每48小时半量更换培养液，pH为6.8‑7.2，原代培养7‑9天；之后每3‑4天采用常规机械法按1∶2‑1∶4传代一次，使绵羊胚胎干细胞体外培养传至16代；其中：无血清培养液的配制：D‑MEM/F‑12+80ng/mL bFGF+3μM CHIR99021+10μL/mL N2+20μL/mL B27+10μL/mL NEAA+2mM L‑Glutamine+0.2mMβ‑Mercaptoethanol；其中：采用32号针头将裸胚固定于培养皿底部，避免损伤囊胚内细胞团，将裸胚滋养层细胞剥离。