| 摘要 |
<p>L'invention concerne des stratégies de RT-PCR permettant l'identification et le clonage de membres de la famille apparentée à la néprilysine. On a conçu et utilisé des amorces oligonucléotidiques dégénérées correspondant à des séquences consensus situées d'un côté ou de l'autre de la séquence consensus HEXXH pour les zincines, dans la RT-PCR avec des ADNc de testicules de souris et d'humains. On a obtenus des fragments d'ADN présentant les longueurs prévues d'une séquence de cette classe d'enzymes. On a cloné et séquencé ces fragments d'ADN. On a identifié trois peptidases apparentées à la zincine, outre les membres connus de la famille, en utilisant cette stratégie PCR et les fragments de PCR en tant que sondes pour le criblages des banques d'ADNc. Les séquences d'ADNc nous ont permis de dériver des sondes spécifiques pour l'hybridation de Northern et in situ, ainsi que de sonder des chromosomes humains pour localiser le gène et établir des liens potentiels avec des maladies génétiques. Par ailleurs, on a utilisé ces séquences d'ADNc pour produire des protéines de fusions recombinées dans Escherichia coli afin d'obtenir des anticorps spécifiques. Pour finir, on a cloné les séquences d'ADNc dans des vecteurs d'expression mammaliens et on les a transfectées dans diverses lignées cellulaires mammaliennes pour produire des enzymes recombinées actives appropriées à l'analyse d'inhibiteurs spécifiques.</p> |
