鱼类精子冷冻保存的实用化方法

摘要

一种鱼类精子冷冻保存的实用化方法，通过比较不同稀释液、抗冻剂和冻存容器的冷冻保存效果，筛选出适宜我国主要鲤科鱼类(青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊等)和主要海水鱼类(鲈鱼、大菱鲆、牙鲆和石鲽等)精子冷冻保存的稀释液配方、抗冻剂及冻存容器；建立了三步冷冻模式和快速解冻方法。上述11种鱼类精子超低温(－196℃)冷冻保存后的活率稳定在65％以上，受精率达80％以上，孵化率达85％以上。建立了上述四种海水鱼类精子冷冻库。用冻存1年的鲈鱼冻精授精，共获鱼苗32万尾；用冻存1年的大菱鲆精子授精获得大菱鲆鱼苗30多万尾。本方法冻存量大、效果好，无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，可用于几乎所有鱼类精子超低温冷冻保存。

主权项

1.一种鱼类精子超低温冷冻保存的实用化方法，其特征在于它的技术操作方法是，包括鱼类精子采集、精子冷冻保存稀释液的配制、选用抗冻剂、精子的稀释与平衡、精子的分装与冷冻、冷冻精液的解冻与授精：精液采集：用毛巾擦干成熟雄鱼生殖孔区域，轻压腹部，用吸管收集挤出的精液。置于干净的小瓶中。精液置冰上短期保存，镜检后将成活率在80％以上的精液用于保存。精子冷冻保存稀释液的配制：淡水鲤科鱼类(包括青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊等)精液稀释液为D-15，其配方为：NaCl 135-136.75mM，KCl 6-6.71mM和葡萄糖83-83.33mM；海水鱼类大菱鲆精子稀释液为TS-2，其配方为：Tris-Cl 9-11mM，pH8.0，蔗糖105-115mM，KHCO3 95-105mM，9-11％胎牛血清(体积比)；鲈鱼、牙鲆和石鲽精子稀释液为MPRS，其配方为：NaCl 59.35-61.35mM，NaH2PO4 1.70-1.90mM，NaHCO3 2.5-3.5mM，KCl 4.73-5.73mM，CaCl2·2H2O 0.63-1.63mM，MgCl2·6H2O 0.63-1.63mM，D-Glucose 50.55-60.55mM。选用的抗冻剂为DMSO，其适宜浓度为8-10％；精子的稀释与平衡：青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊、鲈鱼、牙鲆及石鲽精液与在4℃冰箱中预冷的稀释液按1∶1或1∶2(体积比)的比例混合后，于4℃冰箱平衡20-30min后进行冷冻。而大菱鲆精液则稀释后直接冷冻，无需平衡期。精子的分装与冷冻：将平衡好的精液、稀释液1.0-1.8ml分装于2ml冻存管，按照三步降温模式进行冷冻保存。即在液氮面上方6厘米处平衡10min，在液氮面上平衡5min，然后投入液氮中保存。最佳降温速率是31℃/min(16℃到-15℃)和18.6℃/min(从-12℃到-180℃)。冷冻精液的解冻与授精：解冻时，先将冻存管从液氮中提出置于液氮蒸气中平衡5分钟，然后从液氮罐中拿出，放在37℃水域中快速解冻。冻精解冻后与鲜卵进行人工受精，做法为：将冷冻精液倒于卵子上，搅拌混匀，加少许淡水(鲤科鱼类精子)或海水(海水鱼类精子)激活精子，使之与卵子受精。授精后将受精卵置于孵化器中孵化。