一种高通量裂解大肠杆菌细胞的方法

摘要

一种高通量裂解大肠杆菌细胞的方法，适用于同步裂解不同克隆的大肠杆菌细胞测定诱导表达外源蛋白活性，其裂解过程特征在于：选浓度不低于0.80M且pH为8.5到12.0间对所表达外源蛋白活性及稳定性无显著影响的缓冲液，添加对所表达外源蛋白活性及稳定性无显著影响的中性表面活性剂，得到大肠杆菌细胞的裂解缓冲液；取诱导表达外源蛋白后的大肠杆菌细胞悬液加入5倍及以上体积的裂解缓冲液为待裂解混合物，取0.04ml及以上待裂解混合物到微孔板中，或直接在微孔板中将所需裂解缓冲液和诱导表达外源蛋白后大肠杆菌细胞悬液混合；将微孔板中待裂解混合物室温快速震荡2小时以上得细胞裂解液。

主权项

一种高通量裂解大肠杆菌细胞的方法，适用于在微孔板中同步裂解不同克隆的大肠杆菌细胞测定诱导表达外源蛋白活性，其裂解过程特征在于：(一)筛选缓冲介质：所用缓冲介质的最适缓冲区间在pH 8.5到10.5之间、室温溶解度不低于0.8M，包括但不限于三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐、硼酸盐；(二)针对在大肠杆菌中诱导表达后需测定活性的外源蛋白，按下述筛选表面活性剂：(1)终浓度不高于0.01％时，对测定大肠杆菌中诱导表达外源蛋白的活性无干扰；(2)终浓度不高于0.1％时，与需测定活性外源蛋白作用3小时对活性影响小于10％；(3)候选表面活性剂包括但不限于tween‑20、NP‑40、Triton X‑100；(4)如筛选不到满足要求的表面活性剂，则以下操作过程中不用表面活性剂；(三)制备满足如下要求的候选裂解缓冲液：(1)所选缓冲介质的浓度不低于0.8M，其pH在8.5到12.0间；(2)满足要求表面活性剂的体积浓度或质量浓度不低于0.01％但不高于0.3％；(四)按下述标准筛选合适的裂解缓冲液：(1)需测定活性外源蛋白在所述缓冲液中处理3小时，其活性变化不超过10％；(2)缓冲液稀释10倍以后，对测定大肠杆菌中诱导表达外源蛋白的活性影响低于10％；(3)同时满足上述两项要求的缓冲液，以下简称为裂解缓冲液；(五)按如下所述，将裂解缓冲液与大肠杆菌细胞悬液混合并转移到微孔板中：(1)所用微孔板上，每个微孔的最大容量不小于0.06ml；(2)取不少于10μl大肠杆菌细胞悬液与不少于5倍体积的裂解缓冲液在微孔板中直接混合得待裂解混合物；或在试管中先将不少于10μl的大肠杆菌细胞悬液与不少于5倍体积的裂解缓冲液混合得待裂解混合物，再将不少于0.040ml待裂解混合物转移到微孔板中；(3)每个微孔中待裂解混合物不超过微孔最大容量的90％但不少于微孔最大容量的20％；(六)将微孔板及其待裂解混合物室温持续快速震荡；持续震荡时间不短于2小时，但不长于需测定活性外源蛋白在裂解缓冲液中活性变化小于10％的最长时间，得到裂解液样品。