一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法

摘要

本发明公开了一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其步聚如下：①制备低渗液；②制备伊红-吉姆萨染液；③单纯精子低渗肿胀实验；④离心处理步骤③中所述的低渗处理后精液，弃上清液，并稀释；⑤将步骤④中所述的稀释精液与琼脂凝胶按比例混匀后，进行孵育5分钟得配制精液；⑥将步骤⑤中所述的配制精液置入载玻片上；⑦将所述的载玻片在HCl溶液内浸泡；⑧向所述的载玻片上加入三羟甲基氨基甲烷、二硫苏糖醇和磺化琥珀酸N－月桂基单酰胺二钠盐浸泡成标本片；⑨将步骤⑧中所述的标本片用缓冲液冲洗；⑩将所述标本片脱水； 经步骤⑩脱水后的标本片干燥后加入染液染色。

主权项

1.一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其特征在于：其步聚如下：①制备低渗液低渗液为每100ml蒸馏水中含0.735g柠檬酸钠和1.35g果糖，渗透压是150mOsm的溶液；②制备伊红-吉姆萨染液向每100ml的0.9%的生理盐水中加入0.5g伊红和0.1g吉姆萨，混匀，使其充分溶解，配成染液，再用双层滤纸过滤，所得滤液即伊红-吉姆萨染液，伊红-吉姆萨染液置于22℃室温内保存备用；③单纯精子低渗肿胀实验：向每1ml步骤①中所述的低渗液中加入0.1ml精液，混匀，在水温为37℃的水中水浴30分钟后，得低渗处理后精液，观察200个精子，计算尾部肿胀的精子比率；④取1ml步骤③中所述的低渗处理后精液，用离心机以1000转/分的转速离心处理5 分钟，静置分层后，弃上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液稀释到10×10⁶/ml；⑤取0.2ml步骤④中所述的稀释精液与琼脂凝胶按体积比1：1比例混匀后，放置在离心管内，在室温37℃条件下孵育5分钟得配制精液；⑥吸取50--l步骤⑤中所述的配制精液置入载玻片上，加盖盖玻片，在环境温度4℃的条件下放置4分钟；所述载玻片是表面设有干燥的琼脂层的载玻片；⑦将步骤⑥中所述的载玻片去除盖玻片，在室温22℃条件下放入摩尔浓度为0.081mol/L的HCl溶液内浸泡7分钟；⑧在22℃室温下向步骤⑦所述的载玻片上加入50--l 的0.4mol/L的三羟甲基氨基甲烷，50--l的 0.8mol/L的二硫苏糖醇和50--l的1%（重量）的磺化琥珀酸N－月桂基单酰胺二钠盐，上述三种溶液混合将载玻片浸泡5分钟，浸泡5分钟后的载玻片制成标本片；⑨将步骤⑧中所述的标本片用缓冲液冲洗2分钟，所述缓冲液中各物质含量为：三羟甲基氨基甲烷0.09mol/L和乙二胺四乙酸0.002mol/L；⑩将所述标本片分别放入70%、90%和100%的乙醇中各脱水2分钟； 经步骤⑩脱水后的标本片在空气中自然干燥后加入染液染色，在显微镜下观察结果。