生产具有荧光活性和链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法及应用

摘要

本发明涉及藻蓝蛋白类荧光蛋白质领域，具体为一种生产具有荧光活性和链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法及应用，通过将链霉亲和素合成基因、藻蓝蛋白亚基合成基因、催化酶合成基因、色基合成基因、标签合成基因等重组于同一表达质粒中，实现多基因的组合表达，通过对诱导、纯化条件的优化，制备具备稳定荧光活性的融合蛋白。采用单一质粒完成荧光活性融合藻胆蛋白的组合表达，避免多质粒在工程菌株中的稳定性及各基因表达的不同步问题，减少发酵过程中的抗生素的使用，有效提高了荧光蛋白质的稳定性，大幅降低藻蓝蛋白类荧光标记制剂的制作成本。在生物医学领域，尤其在荧光探针的生产方面具有良好的实用价值和应用前景。

主权项

一种生产具有荧光活性和链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用基因工程的方法，将麦芽糖结合蛋白基因(mbp)或其同源基因或其他类型的蛋白标签基因、藻蓝蛋白类脱辅基蛋白亚基基因(cpcA)或其同源或类似基因、核心链霉亲和素基因(sa)或其同源或其他标签基因、藻蓝蛋白裂合异构酶E和F编码基因(cpcE和cpcF)或其同源基因克隆至同一启动子下；将血红素加氧酶1基因(hox1)或同源基因、藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(pcyA)或其同源基因置于另一启动子下，构建表达质粒pMAC；(2)将步骤(1)所述的表达质粒pMAC转入相应的宿主菌，得到工程菌株BMAC；利用常规的发酵工程方法培养，利用优化的诱导条件进行重组蛋白的诱导表达，采用优化的制备方法进行融合蛋白的纯化制备；步骤(2)的诱导条件为，诱导剂为IPTG、乳糖、半乳糖中的一种或两种以上，诱导剂的终浓度为0.1～5.5mmol/L，诱导温度为18～25℃，诱导时间为8～24h；步骤(2)的蛋白纯化制备方法为，冰浴超声破碎、硫酸铵分级沉淀，蛋白亲和层析柱纯化。