用真核分泌表达系统制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法

摘要

本发明的用真核分泌表达系统制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法，属于生物技术的领域。先将靶基因连同SeCys插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上，再将SeCys插入序列结合蛋白2组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上，将两种载体共转染同一哺乳细胞株，在亚硒酸钠存在下用哺乳细胞合成GPX。本发明方法简单，重组GPX活力和产量高、稳定性好，避免包涵体复性造成的产率下降和失活，从而解决天然GPX来源有限和性质不稳定问题。

主权项

一种用真核分泌表达系统制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法，是用哺乳类细胞制备重组GPX，其特征在于，具体过程是，1)表达载体的构建：在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中GPX基因序列设计引物扩增或直接合成GPX的编码基因，确保GPX基因的5′端含有起始密码子和期望的酶切位点，3′端在终止密码子下游引入硒代半胱氨酸插入序列和期望的酶切位点；用多克隆位点将GPX基因连同硒代半胱氨酸插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2C端的512个氨基酸(343‑854aa)的基因序列设计引物扩增或直接合成其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子和期望的酶切位点，3′端含有终止密码子和期望的酶切位点，用多克隆位点将硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上；所述的多克隆位点，是载体上固有的由多个核酸限制性内切酶识别的碱基组成的DNA序列；2)阳性细胞株的筛选：用含有硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2和GPX基因的载体在转染试剂的介导下共转染哺乳类细胞，用两个载体上的抗性基因通过抗生素浓度从高到低逐级递减法筛选兼具两种抗性的阳性细胞克隆，再用多孔培养板逐级放大培养阳性克隆，最终获得同时稳定表达硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2和GPX两种外源蛋白的阳性细胞株；检测GPX蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；3)靶蛋白的表达与纯化：在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有亚硒酸钠的培养基里用哺乳类细胞表达重组GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里，用谷胱甘肽亲和层析纯化重组GPX，透析冻干后即得酶蛋白纯品。