一种高效增殖丙肝病毒体的方法及该方法所用的载体

摘要

本发明涉及一种高效增殖丙肝病毒的方法及该方法所用的载体。其中所述的载体包括能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体pHCV-2和能表达丙肝病毒蛋白酶和结构酶的载体pHCV-1，所述的方法包括将所述的载体pHCV-2、pHCV-1转染Hela细胞，用含有vTF7-3(ATCC No.VR-2153)重组痘病毒的培养基培养所得到的转染细胞；收集含有丙肝病毒的上清液。

主权项

1、一种能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体pHCV-2，其特征在于所述的载体pHCV-2是通过如下所述的方法制备得到的：(1)用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从丙肝病毒株1a通过PCR合成3’UTR或用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID.NO 3从丙肝病毒株1b通过PCR合成3’UTR；(2)用引物SEQ ID NO.4和步骤(1)合成得到的3’UTR通过PCR合成复盖NS3到3’UTR区域的HCV cDNA片段；(3)用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6通过PCR从HCV cDNA合成复盖5’UTR到N3区域的DNA片段；(4)用步骤(2)和(3)合成的DNA片段为摸板，用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6通过PCR合成HCV全长DNA；(5)将步骤(4)得到的HCV全长DNA克隆到pFK-1(ATCC No.623787)载体HindIII和SpeI位点上；(6)通过点突变，将NS3基因的1202位点的Glu变为Gly，NS3基因的1280位点的Thr变为Ile，以及NS5A的2197位点的Ser变为脯氨酸，得到能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体pHCV-2。