布鲁氏菌菌壳疫苗株的制备方法

摘要

布鲁氏菌菌壳疫苗株的制备方法，涉及分子生物学和微生物学领域，解决了现有菌壳制备方法存在的成本高而不适合大规模生产的问题，该方法为将布鲁氏菌菌株基因组特定基因的上下游同源臂的PCR产物分别克隆至pMD18-T Simple载体中，重组质粒分别经双酶切后依次连接至经酶切处理的质粒pBK-CMV-SacB中构建自杀质粒，PCR扩增温控表达质粒pBV220-E中的温控裂解部件，扩增产物经酶切处理后插入自杀质粒中；将温控裂解型自杀质粒以电转化方式转入布鲁氏菌感受态中，用卡那霉素抗性和果糖蔗糖酶基因进行正负向筛选得到布鲁氏菌菌壳疫苗株。该布鲁氏菌菌壳疫苗株具有良好的遗传稳定性、安全性、有效性和免疫原性。

主权项

布鲁氏菌菌壳疫苗株的制备方法，其特征在于，该方法的条件和步骤下：步骤一、温控裂解型自杀质粒的构建将布鲁氏菌菌株基因组特定基因的上、下游同源臂的PCR产物分别克隆至pMD18‑TSimple载体中，构建重组质粒pMD18‑TS‑F和pMD18‑TS‑R，分别经双酶切后依次连接至经酶切处理的质粒pBK‑CMV‑SacB中，构建自杀质粒pBK‑CMV‑SacB‑ΔB0419，PCR扩增温控表达质粒pBV220‑E中的温控裂解部件TLC片段，扩增产物经酶切处理后插入自杀质粒pBK‑CMV‑SacB‑ΔB0419中，得到温控裂解型自杀质粒pBK‑CMV‑SacB‑ΔB0419‑TLC，并予以PCR验证；步骤二、布鲁氏菌菌壳疫苗株的筛选与鉴定将温控裂解型自杀质粒pBK‑CMV‑SacB‑ΔB0419‑TLC以电转化方式转入布鲁氏菌感受态中，利用卡那霉素抗性Kan^R和果糖蔗糖酶基因SacB进行正、负向筛选，得到无抗性的布鲁氏菌菌壳疫苗株；步骤三、制备方法的条件优化将步骤二得到的布鲁氏菌菌壳疫苗株置于28℃的TSB培养基中培养至布鲁氏菌不同生长期，升温至42℃培养，每6小时取菌液测量其OD₆₀₀值并适当稀释涂板计算CFU值，分析并确定其最佳诱导条件。