一种快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的方法

摘要

本发明公开了一种快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的方法，属于工业微生物育种技术领域。传统的L-精氨酸高产菌株的筛选方法是通过筛选抗L-精氨酸结构类似物的菌株。本发明构建了一株大肠杆菌L-精氨酸缺陷型菌株作为L-精氨酸分泌的指示菌，TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)是一种活细胞指示剂，它能被活细胞产生的还原氢还原成红色。将上述L-精氨酸缺陷型菌株作为L-精氨酸分泌的指示菌通过交互共养法以TTC为显色剂实现L-精氨酸生产菌株胞外L-精氨酸浓度高低的定性筛选，在平板上初筛出合成L-精氨酸能力高或分泌性能较优型菌株，该方法大大提高了菌种选育中的筛选效率而且节约了成本。

主权项

一种快速高效筛选L‑精氨酸高产菌株的方法，其特征在于构建一株大肠杆菌BL21L‑精氨酸缺陷型菌株，并以所述的L‑精氨酸缺陷型菌株作为L‑精氨酸分泌的指示菌通过交互共养法以活细胞指示剂2，3，5‑氯化三苯基四氮唑为显色剂实现L‑精氨酸浓度高低的定性筛选，在平板上筛选出合成L‑精氨酸能力高或分泌性能较优型菌株；所述的大肠杆菌BL21L‑精氨酸缺陷型菌株构建方法如下：(1)、argBH的扩增：以E.coli BL21基因组DNA为模板，用引物P15’‑CGCGAATTCATGAATCCATTAATTATCAAACTGG‑3’，P25’‑CGCGTCGACTTACCCTAACCGAGCCTGC‑3’扩增argBH基因，扩增循环条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环；(2)、质粒pMD‑18T‑argBH::Kan的构建：PCR获得的argBH基因片段电泳胶回收后与pMD‑18T载体16℃过夜连接，转化E.coli JM109，挑取阳性转化子并验证获得含有质粒pMD‑18T‑argBH的E.coli JM109；将T‑Kan用EcoRV酶切后胶回收其中大小为1.4kb的包含Kan抗性基因的片段，并将其与同样用EcoRV酶切后的pMD‑18T‑argBH进行连接，EcoRV位点位于argH内部，转化E.coli JM109，挑取阳性转化子并验证获得含质粒T‑argBH::Kan的E.coli JM109；(3)、E.coli BL21精氨酸缺陷型菌株的获得：将重组质粒T‑argBH::Kan以EcoRI、XhoI酶切，胶回收得到argBH::Kan片段；热击转化E.coli BL21，卡那霉素抗性平板上筛选阳性转化子；将得到的阳性转化子分别点种于MM基本培养基平板和SM补充培养基平板对比培养，在MM平板上无法生长，在添加了L‑精氨酸的SM平板上正常生长的初步认为是L‑精氨酸缺陷菌株；提取转化子的染色体DNA，用argBH基因的引物扩增argBH::Kan，验证阳性转化子；由此获得E.coli BL21L‑精氨酸缺陷型菌株。