一种在活细胞内精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法

摘要

本发明涉及一种在活细胞内精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法。采用的技术方案是：1)将荧光标签GFP基因插在野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ATCC208719)朊病毒[PSI+]的编码基因SUP35的N和M结构域中间，得到荧光标记[PSI+]朊病毒的[GPSI+]酵母细胞；2)将[GPSI+]酵母细胞的活化；3)通过观察菌落颜色的变化对抗朊病毒药物进行初筛选；4)用荧光漂白后恢复技术FRAP定量检测抗朊病毒药物作用效果。本发明具有方便以及能够在活细胞中精确定量检测药物对朊病毒的治愈作用的优点，为筛选抗朊病毒药物提供一种快捷、准确的评价作用效果的方法。

主权项

一种在活细胞内精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法，其特征在于步骤如下：1)[GPSI+]酵母细胞的制备：将荧光标签GFP基因插在野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，ATCC，208719)朊病毒[PSI+]的编码基因SUP35的N和M结构域中间，得到荧光标记[PSI+]朊病毒的[GPSI+]酵母细胞；2)[GPSI+]酵母细胞的活化：将[GPSI+]酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30℃振荡过夜培养，然后调整[GPSI+]酵母细胞悬液OD600＝0.2；3)抗朊病毒药物的初筛选：取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以及调试好的[GPSI+]酵母细胞悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的[GPSI+]酵母细胞放入新的装有1/2YPD培养液和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养5天；从第一天起，隔天提取100μl前一天的冻存管中的酵母细胞悬液，稀释后，在1/2YPD固体培养基上涂布；将涂布的培养皿置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，通过观察菌落颜色的变化初步判断待测药物的治疗效果；4)用荧光漂白恢复技术定量检测抗朊病毒药物作用效果：培养：取3)步中，经药物治疗不同时间后稀释涂在1/2YPD平板上长出的单菌落，按菌落颜色分组，挑选每组的菌落在YPAD培养液中30℃振荡过夜培养；制样片：在无菌载玻片上滴一滴2mg/mL刀豆球蛋白溶液，用无菌接种环铺开，区域大小与盖玻片大小相当，自然晾干，将培养后的菌落稀释后滴一滴在载玻片上，盖上盖玻片，指甲油封片。检测：将样片置于激光共聚焦显微镜下，设置激发波长为488nm，输出功率为最大输出功率的2％，针孔调整为3μm，物镜为40倍，扫描整个样品，确定细胞，选取漂白区，漂白功率为100％，漂白程度为50～80％，漂白后采集图像时间间隔为0.5秒，采集图像次数为40～50次，漂白结束后，保存图像，分析数据。