一种花生致敏蛋白Arah2标准品的制备方法

摘要

一种花生致敏蛋白Arah2标准品的制备方法，属于蛋白的制备方法。其包括以下工艺步骤：1）脱脂；2）粗提液的制备；3）硫酸铵分级沉淀；4）等电点沉淀；5）透析；6）离子交换层析；7）免疫亲和层析。本发明通过液氮超微粉碎，低温离心，有机脱脂萃取等多种方法相结合制得脱脂花生蛋白粉，最大程度的保留了其生物活性，并通过硫酸铵沉淀，等电点沉淀，离子交换层析和结合单抗的免疫亲和层析，最大程度的提高了花生过敏原的纯度和免疫活性，并可达到了规模化制备的要求。

主权项

一种花生致敏蛋白Arah2标准品的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）脱脂取花生种子在60℃的烘箱中烘烤6小时，去红皮，液氮冻融后用粉碎机粉碎，按照花生粉末质量：正己烷体积为1：2进行‑20℃过夜萃取，4℃下10000r/m离心10min，倾去正己烷，脱脂粉风干后过60目筛，4℃保存备用；2）粗提液的制备取花生粉以10ml/g加入至pH8.0、浓度0.5M的Tris‑HCL溶液中混合,超微粉碎、超速离心，超微粉碎条件：200W的超声破碎仪中超声100s，每次5s，间隔1s；超速离心条件：4℃下10000‑12000r/min 离心10‑15min，得到花生蛋白上清液；3）硫酸铵分级沉淀取花生蛋白上清液，花生蛋白上清液中缓慢加入硫酸铵，边加边搅拌，直至溶液中硫酸铵饱和度达30%，静置，离心；离心后的上清液中继续缓慢加入硫酸铵直至饱和度达50%，静置，离心；离心后的上清液中继续缓慢加入硫酸铵直至饱和度达70%，静置，离心；收集沉淀，用pH 7.4、浓度0.01mol/L的PBS缓冲液复溶，4℃保存，得到沉淀复溶物Ⅰ；4）等电点沉淀取沉淀复溶物Ⅰ加1mol/l的HCL至等电点为5.2，静置、离心；沉淀用pH 7.4、浓度0.01mol/L的PBS缓冲液复溶，4℃保存，得到沉淀复溶物Ⅱ；5）透析取沉淀复溶物Ⅱ装入透析袋中,用PEG20000透析，得到花生蛋白粗提液；6）离子交换层析采用DEAE‑Sepharose Fast Flow离子柱层析，用pH8.0、浓度50mol/L Tris‑HCl 缓冲溶液平衡，以0.3mol/L NaCl洗脱溶液进行洗脱，蠕动泵流速1ml/min，5min间隔自动收集，检测280nm吸收，收集洗脱液，透析，浓缩，得到花生致敏粗蛋白；7）免疫亲和层析制备免疫亲和柱，将花生致敏粗蛋白经偶联了抗Arah2 致敏蛋白的单克隆抗体的免疫亲和柱层析，以pH2.4、浓度0.l mol/ L的glycine‑HCL溶液洗脱，洗脱速度为0.5～2ml/min，收集洗脱液，得到花生致敏蛋白Arah2标准品。