一种小叶红豆离体胚培养及植株再生方法

摘要

本发明属于经济林的栽培方法，特别是涉及小叶红豆离体胚培养及植株再生方法。本发明采用胚芽诱导培养、初代芽诱导培养、芽增殖培养、壮苗培养、诱导生根培养，完成小叶红豆的离体胚培养及植株再生培养，该培养方法扩繁系数较高，萌发时间短，增殖速度快，经壮苗培养，成苗移植后的成活率高，苗木健壮挺拔，长势良好，对高效保育珍稀濒危小叶红豆资源具有重要的理论意义和较高经济价值及开发利用前景。

主权项

一种小叶红豆离体胚培养及植株再生方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1）取材方法：选取当年结实、籽粒饱满的豆荚为材料，采摘后置3‑5℃冰箱冷藏保存备用；2）培养基的配制：分别配制胚芽诱导培养基、初代芽诱导培养基、芽增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基；所述胚芽诱导培养基：1/2MS + 1.0mg·L^‑1BA + 0.5mg·L^‑1 IAA + 0.2mg·L^‑1NAA +6.0g·L^‑1琼脂  +20g·L^‑1蔗糖 +1.0 g·L^‑1活性炭；初代芽诱导培养基：WPM + 1.5mg·L^‑1BA + 0.5mg·L^‑1KT + 0.5mg·L^‑1IAA + 0.5mg·L^‑1NAA + 6g·L^‑1琼脂 + 20g·L^‑1蔗糖 + 1.0 g·L^‑1活性炭；芽增殖培养基：WPM + 1.5mg·L^‑1BA + 1.0mg·L^‑1KT + 0.25mg·L^‑1TDZ + 0.5mg·L^‑1NAA + 6.0g·L^‑1琼脂  +20g·L^‑1蔗糖 + 1.0g·L^‑1活性炭；壮苗培养基：WPM+1.0mg·L^‑1BA+0.5mg·L^‑1KT+0.5mg·L^‑1NAA+1.0mg·L^‑1IAA+6.0g·L^‑1琼脂 +20g·L^‑1蔗糖 +1.0g·L^‑1活性炭；生根培养基：1/2 WPM + 0.5mg·L^‑1NAA  +1.0mg·L^‑1IBA + 6.0g·L^‑1琼脂  +20g·L^‑1蔗糖 +1.0 g·L^‑1活性炭；这些培养基的PH值为5.8，培养基厚度为1.4 cm；或，所述胚芽诱导培养基：1/2MS + 1.5mg·L^‑1BA + 1.0mg·L^‑1 IAA + 0.3mg·L^‑1NAA + 6.0g·L^‑1琼脂  +20g·L^‑1蔗糖 +1.5 g·L^‑1活性炭；初代芽诱导培养基：WPM +2.0mg·L^‑1BA +0.6mg·L^‑1KT +0.6mg·L^‑1IAA+ 0.6mg·L^‑1NAA+ 6.0g·L^‑1琼脂+20g·L^‑1蔗糖+1.5 g·L^‑1活性炭；芽增殖培养基：WPM+2.0mg·L^‑1BA +1.5mg·L^‑1KT+0.5mg·L^‑1TDZ+0.6mg·L^‑1NAA + 6.0g·L^‑1琼脂  +20g·L^‑1蔗糖 +1.5 g·L^‑1活性炭；壮苗培养基：WPM+0.7mg·L^‑1BA+0.25mg·L^‑1KT+0.25mg·L^‑1NAA+0.7mg·L^‑1IAA+6.0g·L^‑1琼脂 +20g·L^‑1蔗糖 +1.5 g·L^‑1活性炭；生根培养基：1/2 WPM +0.6mg·L^‑1NAA  +1.5mg·L^‑1IBA + 6.0g·L^‑1琼脂 +20g·L^‑1蔗糖 +1.5 g·L^‑1活性炭；这些培养基的PH值为5.7，培养基厚度为1.6 cm；或，所述胚芽诱导培养基：1/2MS+ 0.5mg·L^‑1BA + 0.4mg·L^‑1 IAA + 0.1mg·L^‑1NAA + 6.0g·L^‑1琼脂  +20g·L^‑1蔗糖 +1.2 g·L^‑1活性炭；初代芽诱导培养基：WPM+1.0mg·L^‑1BA+0.4mg·L^‑1KT+0.4mg·L^‑1IAA+0.4mg·L^‑1NAA+ 6.0g·L^‑1琼脂  +20g·L^‑1蔗糖 +1.2 g·L^‑1活性炭；芽增殖培养基：WPM+1.0mg·L^‑1BA +0.5mg·L^‑1KT+0.1mg·L^‑1TDZ+0.4mg·L^‑1NAA + 6.0g·L^‑1琼脂  +20g·L^‑1蔗糖 +1.2 g·L^‑1活性炭；壮苗培养基：WPM+0.5mg·L^‑1BA+0.1mg·L^‑1KT+0.1mg·L^‑1NAA+0.5mg·L^‑1IAA+6.0g·L^‑1琼脂 +20g·L^‑1蔗糖 +1.0 g·L^‑1活性炭；生根培养基：1/2 WPM+ 0.4mg·L^‑1NAA  +0.5mg·L^‑1IBA + 6.0g·L^‑1琼脂  +20g·L^‑1蔗糖 +1.2 g·L^‑1活性炭；这些培养基的PH值为5.9，培养基厚度为1.5 cm；    3）材料消毒处理：豆荚用自来水进行表面冲洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15‑20min，用自来水滴冲1‑1.5h后去除豆荚外壳，取出种子，用双蒸水冲洗2‑3遍，在超净工作台上用质量分数为75%酒精消毒20‑40s，用质量分数为0.1%升汞消毒15‑17min，无菌水冲3‑4遍后，用消毒滤纸吸干种子表面水分，放在灭过菌的培养皿上，去除位于生长点1/10部分坚硬种子外壳及蜡质层后接种于胚芽诱导培养基上；4）胚芽诱导培养：100～150g胚芽诱导培养基接种种胚2‑4个；所述胚芽诱导的培养条件：培养室温度为23±2℃，前15～20天暗培养，后20～25天光照时间11‑12 h/d，光照强度为1000～1500lx；5）初代芽诱导培养：将经上述胚芽诱导培养，得到的生长良好的芽切成1～2cm长的带腋芽茎段，接种在初代芽诱导培养基中进行诱导培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11‑12h/d，光照强度为1500‑2000lx，诱导培养时间30～50天；6）芽增殖培养：将经上述初代芽诱导培养，得到的生长良好的增殖芽切成1～2cm长的带腋芽茎段，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11‑12h/d，光照强度为1500‑2000lx，增殖培养时间35～55天；7）壮苗培养：将经上述芽增殖培养，得到高2‑3cm完整的幼苗单株切下，接种在壮苗培养基中进行壮苗培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11‑12h/d，光照强度为1500‑2000lx，壮苗培养时间20～30天；    8）诱导生根培养：将经壮苗培养培养出来的带有2‑4片叶子、株高2‑4cm的幼苗单株转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11‑12h/d，光照强度为1500‑2000lx，生根培养时间25‑35天；9）试管苗完成：当试管苗长至2‑4cm高，有3‑5条形态正常的根，有4‑6片叶子，叶长2‑3cm时，完成小叶红豆的离体胚培养及植株再生培养。