差动共焦拉曼光谱测试方法

摘要

本发明属于显微光谱成像技术领域，涉及一种差动共焦拉曼光谱测试方法。该方法融合差动共焦检测方法和拉曼光谱检测方法技术特点，构成一种可实现样品微区光谱检测的测试方法，通过差动共焦技术精确捕捉激发光束聚焦焦点位置，探测对应位置的拉曼光谱，同时采用设计的光瞳滤波器，锐化差动共焦拉曼光谱系统的爱里斑主瓣，改善其微区拉曼光谱探测能力，精确获取包括微区样品光谱信息和位置信息的微区空间光谱信息。本发明显著提高了共焦拉曼光谱显微镜的微区光谱探测能力；具有绝对跟踪零点和双极性跟踪特性，实现几何尺度绝对测量；可广泛应用于生物医学、生命科学、生物物理、生物化学、材料、工业精密检测等技术领域，进行微区几何位置和光谱特性的高精度检测，具有极其重要的应用前景。

主权项

1.一种差动共焦拉曼光谱测试方法，实现本方法的装置包括激光器(1)、偏振分光镜(2)、1/4波片(3)、聚焦物镜(4)、两个聚光镜(8、10)、两个针孔(11、12)，两个探测器(13、14)、两个分光镜(5、6)、被测样品(7)、三维工作台(9)、聚焦信号差动相减处理单元(15)、光谱检测系统(16)、计算机处理系统(17)、光瞳滤波器(18)、滤光片(19)、扩束器(20)，其特征在于：首先通过差动共焦技术精确捕捉激发光束聚焦焦点位置，然后探测对应该位置的拉曼光谱；采用光瞳滤波器，对差动共焦拉曼光谱仪器的光瞳函数进行掩膜修正，锐化爱里斑主瓣，进一步改善差动共焦拉曼光谱系统的微区光谱探测能力；通过差动共焦光路布置及差动探测来提高轴向分辨力，实现样品微区三维尺度及光谱特性的高信噪比检测；该方法的具体实现步骤如下：1)使可激发出样品拉曼光谱的激发光束透过偏振分光镜(2)、1/4波片(3)、聚焦物镜(4)后，聚焦在被测样品(7)上，并激发出载有样品光谱特性的拉曼散射光；2)移动被测样品(7)，使激发光及对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次通过1/4波片(3)并被偏振分光镜(2)反射，利用两分光镜(5、6)将偏振分光镜(2)反射的激发光和拉曼光谱分别进行分光；3)利用差动共焦显微系统的所述两个探测器(13、14)，分别探测第一分光镜(5)透射的光束，测得反映被测样品凸凹变化的强度响应I_A(v，u，-u_M)和I_B(v，u，+u_M)，并将I_A(v，u，-u_M)和I_B(v，u，+u_M)差动相减，得差动共焦强度响应I(v，u)，其中，v为横向归一化光学坐标，u为轴向归一化光学坐标，u_M为针孔轴向归一化光学偏移量；4)利用光谱检测系统(16)检测第一分光镜(5)反射的光束，测得载有被测样品光谱信息的拉曼散射光谱I(λ)，其中λ为波长；5)使被测样品沿x、y向扫描，聚焦物镜(4)沿z向扫描，利用步骤3)和步骤4)所示的方法，测得对应物镜聚焦点位置附近的一组i个差动共焦强度响应I(v，u)和载有被测样品光谱信息的拉曼散射光谱I(λ)的序列测量信息{I_i(λ)，I_i(v，u)}；6)利用可分辨区域σ_i对应的差动共焦强度响应I_i(v，u)，找出对应σ_i区域的光谱信息I_i(λ)值，再依据v与横向位置坐标(x，y)的关系以及u与轴向位置坐标z的关系，重构反映被测物可分辨区域σ_i三维尺度和光谱特性的信息I_i(x_i，y_i，z_i，λ_i)；即实现了微区几何尺寸(x，y，z)和载有被测样品光谱信息的拉曼散射光谱I(λ)的高精度检测；7)对应最小可分辨区域σ_min的三维尺度和光谱特性可由下式确定：8)优化光瞳滤波器(18)参数，压缩激发聚焦光斑的尺寸，提高微区光谱探测能力。